Действие оперы происходит в июне 1800 года на фоне следующих исторических событий. Италия долго представляла собой ряд независимых городов и земель, в центре страны находилась Папская область. В 1796 году французская армия под командованием Наполеона вторглась в Италию, вошла в Рим в 1798 году и установила там республику. Республика управлялась семью консулами; один из этих консулов, Либеро Анджелуччи, мог быть прототипом Чезаре Анджелотти. Защищавшие республику французы в 1799 оставили Рим, который был оккупирован войсками Неаполитанского королевства.
В мае 1800 года Наполеон снова ввёл войска в Италию, а 14 июня его армия встретилась с австрийской в битве при Маренго. Главнокомандующий австрийцев Мелас, будучи уверенным в своей победе, послал гонца в Рим, однако Наполеон к вечеру получил подкрепление и сумел одержать победу, и Меласу пришлось послать второго гонца вслед за первым. После этих событий неаполитанцы ушли из Рима, и французы на четырнадцать лет завладели городом.
Действие первое.
Анджелотти, бежавший из заключения республиканец, находит убежище в римской церкви Сант-Андреа-делла-Валле. Он прячется в капелле Аттаванти, ключ от которой под статуей Мадонны оставила его сестра, маркиза Аттаванти. Не замечая беглеца, в церковь входит ризничий, который приносит еду для работающего здесь художника Марио Каварадосси. За ризничим появляется сам Марио: картина с образом Марии Магдалины закончена лишь наполовину. Каварадосси поет арию Recondita armonia, где сравнивает облик своей возлюбленной, певицы Флории Тоски, с чертами святой. Ризничий оставляет Марио. Анджелотти, думая, что в церкви никого нет, выходит из капеллы и встречает Каварадосси, своего старого друга. Их беседа прервана стуком в дверь: Флория Тоска требует, чтобы ей открыли. Анджелотти снова прячется. Входит Тоска. Ревнивой красавице кажется, что на портрете Марио изобразил её соперницу. Каварадосси успокаивает её подозрения, и они договариваются встретиться вечером у него, после того, как Тоска выступит во дворце Фарнезе. Флория уходит. Каварадосси вместе с Анджелотти также покидают церковь — художник решил спрятать друга у себя дома.
В это время в Рим приходит известие о поражении Наполеона на севере Италии. По этому случаю в церкви готовятся к торжественному богослужению. Появляется Скарпиа, шеф полиции, влюблённый в Тоску. Вместе с сыщиком Сполеттой он обнаружил доказательства того, что Анджелотти прячется здесь. Одна из улик — веер с гербом Аттаванти, который Скарпиа использовал, чтобы разбудить ревнивые подозрения Тоски.
Во время богослужения в церковь входит множество людей. Пока в честь победы над Наполеоном звучит Te Deum, Скарпиа остаётся в церкви, он целиком поглощён коварным планом отправить своего соперника Каварадосси на эшафот.
Действие второе.
Дворец Фарнезе. В этот же вечер здесь отмечается победа над французами. Скарпиа в своём кабинете в отделении полиции, которое находится во дворце, слышит отдалённые звуки музыки и размышляет о случившемся за день. С жандармом Скьярроне он посылает записку Тоске. Сполетта обыскал дом Каварадосси, не нашёл там Анджелотти, но застал там Тоску. Каварадосси арестован и приведён во дворец. Его допрос прошёл безрезультатно. Появляется Тоска и Каварадосси успевает тайком сказать ей, что должна молчать о том, что видела у него дома. Скарпиа отправляет художника в камеру пыток.
Скарпиа допрашивает Тоску. Она спокойна, но лишь до той минуты, пока не слышит из камеры крики истязаемого Каварадосси. В отчаянии она выдаёт убежище Анджелотти — он прячется в садовом колодце. Каварадосси снова приводят в кабинет Скарпиа. Он понимает, что Тоска всё рассказала. Неожиданно приходит известие о победе Наполеона в Маренго. Каварадосси не скрывает своей радости. Скарпиа отдаёт приказание казнить его на следующее же утро. При этом
делает Тоске непристойное предложение.
Тоска совершенно растеряна и подавлена происходящим. Звучит ария Vissi d'arte. Но ради спасения возлюбленного Тоска соглашается принести себя в жертву. Скарпиа убеждает её, что должен создать видимость приготовлений к казни Каварадосси. Он отдаёт Сполетте необходимые распоряжения и одновременно выписывает пропуск для Тоски и художника, чтобы они могли бежать из Рима. Однако, когда Скарпиа поворачивается к ней, чтобы обнять, Тоска наносит ему удар кинжалом. Она спешно покидает дворец, унося с собой пропуск.
Действие третье.
Площадь тюрьмы Сант-Анджело. Каварадосси выводят на тюремную крышу, здесь он будет казнён. Он пишет последнее письмо Тоске. Звучит ария Каварадосси E lucevan le stelle. Неожиданно появляется Флория. Она рассказывает об убийстве Скарпиа, показывает возлюбленному пропуска и сообщает ему, что казнь будет ложной. Флория и Марио уверены, что они спасены.
Появляются солдаты во главе со Сполеттой. Каварадосси спокойно встает перед ними. Выстрелы, Марио падает, солдаты уходят. Только теперь Тоска понимает, что она была обманута Скарпиа: патроны были настоящими, и Каварадосси мёртв. Обезумевшая от горя женщина не слышит, что солдаты вернулись. Смерть Скарпиа обнаружена, Сполетта пытается задержать Тоску. Она бросается с крыши замка вниз.
